Vitesse de refroidissement et nitrites : impact sur Clostridium botulinum dans le jambon cuit

Les nitrites en tant qu’additif alimentaire, contribuent à la sécurité microbiologique, la couleur et, par sa fonction antioxydante, à l’arôme des produits de charcuterie et de salaison. Pour certaines charcuteries vulnérables sur le plan microbiologique comme le jambon cuit, son utilisation (et dans une moindre mesure celle du sel) permet de garantir un niveau de sécurité suffisant vis-à-vis de C. botulinum (EFSA, 2010 ; Lebrun et al., 2020). Dans son avis de 2010, l’EFSA indique que pour certains produits, à teneur réduite en sel et présentant une durée de vie longue (plusieurs semaines), l’ajout de 50 à 150 mg/kg de nitrites est recommandé pour inhiber la croissance de C. botulinum. Un taux d’incorporation maximal de 90 mg de nitrites de sodium (NaNO2, E250) par kg est actuellement stipulé pour les pièces cuites dans le code des usages de la charcuterie, de la salaison et des conserves de viandes (mise à jour 2025). Ce taux est inférieur à celui imposé par la réglementation européenne i.e. 120 mg NaNO2 par kg (Règlement (UE) 2023/2108).
Cette volonté de réduire, voire supprimer les nitrites dans certaines catégories de produits, fait notamment suite à l’avis de l’ANSES publié en juillet 2022, soulignant l’existence d’une association positive entre l’exposition aux nitrates et/ou aux nitrites via la viande transformée et le risque de cancer colorectal (ANSES, 2022). Celle-ci s’ajoute à la démarche de réduction de la teneur en sel dans les produits, dont l’excès de consommation est reconnu comme un des facteurs de risque de l’hypertension artérielle et par conséquent de maladies cardiovasculaires. Cependant, leur diminution dans le jambon cuit pourrait favoriser le développement microbien, et notamment celui des formes végétatives de C. botulinum psychrotrophe (groupe II non protéolytique type B, dont la température minimale de croissance est de 2,5°C - ANSES, 2019) durant sa conservation. Des travaux antérieurs menés par l’IFIP et l’Université de Liège avaient d’ores et déjà montré qu’une dose d’emploi en nitrites de sodium ≥ 30 mg/kg (indépendamment de la dose de NaCl employée i.e. de 12 à 18 g/kg viande) permettait de garantir l’absence de croissance de C. botulinum gr II type B durant la conservation (14 jours à 4°C + 33 jours à 8°C) d’un jambon cuit modèle (à base de viande de porc hachée) suivant un refroidissement standard d’environ 13,5 h (permettant de passer de 67°C à 4°C). En revanche, l’absence de nitrite permettait la croissance et la production de toxine botulique (Lebrun et al., 2020). Par ailleurs, des souches de C. botulinum mésophiles gr. I (type A) et psychrotrophes gr. II (type B) inoculées en mélange dans le même jambon cuit modèle, n’étaient pas capables de se développer et de produire leurs toxines botuliques durant un refroidissement post-cuisson lent d’environ 27 h (incluant environ 23 h entre 48°C et 4°C, plage de température susceptible de permettre la croissance de C. botulinum), et ce, même pour la recette sans sel nitrité ajouté et avec une teneur cible en NaCl réduite de 25 % (i.e. 13,5 g NaCl par kg) (Frémaux et al., 2020).
Aucune étude scientifique n’a toutefois été menée pour évaluer l’impact d’un refroidissement lent, qu’il est possible de rencontrer dans certaines situations (e.g. incidents de fabrication, éventuel point chaud dans certaines cellules de refroidissement ou encore le refroidissement de très grosses pièces de jambon cuit), sur le comportement de C. botulinum psychrotrophe durant la phase ultérieure de conservation. Il est en effet possible qu’un tel refroidissement puisse favoriser la germination des spores et la reprise de croissance des formes végétatives lorsque les conditions deviennent favorables. Ceci pourrait s’avérer critique dans du jambon cuit formulé sans nitrite ajouté ou avec une teneur significativement réduite. Aussi, cette étude avait pour objectif d’évaluer l’impact de deux barèmes de cuisson et refroidissement, l’un comportant un refroidissement post-cuisson lent (28,5 h), le second, un refroidissement standard (10 h), sur le développement de C. botulinum psychrotrophe gr. II type B durant la conservation d’un jambon cuit modèle à teneurs réduites en nitrites de sodium (0 à 60 mg/kg) et en NaCl (18 g/kg versus un taux réduit de -25 % i.e. 13,5 g/kg).

II. MATERIELS ET METHODES

II.1. Souches de C. botulinum utilisées
Un cocktail de 3 souches de C. botulinum groupe II (non-protéolytique) type B (BL7, 300-05 et 815-12), toutes toxinogènes, ont été utilisées pour ces essais. Toutes provenaient de la collection de l’Institut Pasteur (Paris, France) :
- Souche BL7 C. botulinum gr. II type B, souche de collection, origine Royaume-Uni.
- Souche 300-05 C. botulinum gr. II type B, isolée par le CNR en 2005 à partir d'un jambon sec de préparation familiale (département 46).
- Souche 815-12 C. botulinum gr. II type B, isolée par le CNR en 2012 à partir d'un jambon sec de préparation familiale (département 63).
La toxinogenèse de ces souches a préalablement été vérifiée après ensemencement dans de la mêlée de viande crue de porc conditionnée sous vide. Les trois souches de C. botulinum gr. II type B ont donné des résultats variables en titres de toxines botuliques, i.e. 120 (souche BL7), 3800 (souche 300-05) et 4800 (souche 815-12) DLS/g après trypsinisation à
200 µg/ml à température ambiante de l’extrait et injection chez la souris. Ceci reflète les conditions pouvant être rencontrées naturellement, à savoir la variabilité du risque de botulisme selon les souches (Lebrun et al., 2020).

II.2. Préparation des spores de C. botulinum groupe II type B
Les trois souches de C. botulinum gr. II type B (BL7, 300-05 et 815-12), conservées sous forme de cryotubes congelés à -80 °C, ont été individuellement cultivées en milieu BHI à +30 °C pendant douze semaines en anaérobiose pour provoquer la germination des spores, la croissance des formes végétatives et la sporulation. Les cellules ont ensuite été exposées à un choc thermique à +60 °C pendant 20 minutes pour détruire les formes végétatives et sélectionner les spores. Les spores ont été centrifugées à 4 500 g pendant 20 minutes, lavées puis remises en suspension dans de l’eau physiologique. Un pool des trois suspensions (à concentrations équivalentes en spores) a ensuite servi à l’ensemencement des échantillons.

II.3. Préparation des différentes recettes
Tenant compte de l’impossibilité technique d’inoculer un jambon dans toute sa masse, il a été proposé d’utiliser le jambon cuit modèle utilisé antérieurement par Lebrun et al. (2020) dans une étude visant à mesurer l’impact de différentes teneurs en nitrites et en NaCl sur le développement de C. botulinum groupe II type B et la production associée de toxine botulique lors de la fabrication et de la conservation de jambon cuit. Ce modèle avait été initialement proposé par Redondo-Solano et al. (2013) pour étudier la croissance de Clostridium perfringens dans du jambon cuit selon différentes modalités.
Ce modèle est constitué de viande hachée de porc et des ingrédients sélectionnés. En tant que muscle 4D (dégraissé, désossé, dénervé et découenné) et de composition homogène, le « filet d’Anvers » de porc (grosse noix) a été choisi comme matière première pour la fabrication du jambon cuit modèle. Cinq recettes (notées de R1 à R5) ont été testées en plus de la recette témoin (RT), laquelle a été préparée sans ajout de NaCl et de sel nitrité (Tableau 1).
Pour chaque recette, la viande a été hachée deux fois dans un hachoir (hachoir TX 98 Compact, Dadaux®, France) à une granulométrie de 4,5 mm jusqu’à l’obtention d’une masse homogène. Après hachage, la mêlée a été divisée en autant de portions que de recettes testées. Chaque portion a été saumurée à un taux de 10,0 % (soit 0,1 kg pour 1 kg de viande de porc) avec une saumure appropriée dont la teneur en dextrose et érythorbate de sodium était constante mais dont la teneur en sel et en sel nitrité a été ajustée (R1 à R5), pour obtenir les concentrations indiquées dans le Tableau 1.

Tableau 1 : Composition des recettes testées (exprimée par kg de viande).

II.4. Inoculation des spores de C. botulinum et conditionnement
Pour chacune des recettes, une partie de la viande hachée a été contaminée à l’aide de la suspension de spores préparée à partir des 3 souches de C. botulinum gr. II type B à un taux d’inoculation cible de 3,2 Log10 spores par gramme de viande (inoculum expérimental moyen de 3,21 ± 0,62 Log10 UFC/g, toutes recettes et barèmes de cuisson/refroidissement confondus). Pour obtenir une bonne répartition des spores dans la viande après inoculation, celle-ci a été mélangée dans un robot Kenwood Major Titanium (Kenwood, Japon) à la vitesse « 1 » pendant 10 minutes. La viande ainsi ensemencée a ensuite été répartie en portions de 50 g dans des sachets Cryovac® CN 300 (Sealed Air, France) ayant une très faible perméabilité à l’oxygène (taux de transmission de l’oxygène de 13 cm³/m² après 24 h à une pression de 1 bar et à 23°C). L’autre partie de la viande hachée non ensemencée (servant entre autres à la réalisation des analyses physico-chimiques et à la vérification du niveau de contamination naturelle par C. botulinum) a été répartie de la même manière en sachets de 50 g. Tous les sachets ont été mis sous vide au moyen d’une machine simple cloche INV 10 (Intervac®, France), puis cuits et refroidis selon les deux barèmes ci-dessous.

II.5. Barèmes de cuisson et de refroidissement
Les courbes de cuisson et de refroidissement testées ont été acquises au sein d’entreprises charcutières volontaires via l’utilisation de sondes de température positionnées à cœur de barres de jambon cuit. Notamment, le cas le plus défavorable enregistré chez un industriel charcutier en 2018 (jambon cuit localisé au point le plus chaud d’une cellule de refroidissement) a été retenu pour simuler le barème thermique incluant un refroidissement lent.
Les deux courbes ont été reproduites expérimentalement sur le jambon cuit modèle au sein de l’unité pilote de l’Université de Liège. La cuisson a été réalisée dans une enceinte combinée Spakomat SPM 550 (Spako®, Pays-Bas) ; le refroidissement a été réalisé dans une enceinte climatique réfrigérée (MIR-253, Sanyo®, Japon). Pour déterminer l’évolution de la température à cœur du jambon cuit modèle durant la cuisson et le refroidissement, respectivement dans le four et l’enceinte climatique, une sonde de température (sonde de pénétration de type CTN, Testo AG 06102217-803 [thermistance à coefficient de température négatif], Testo®, Allemagne) a été introduite au cœur d’un échantillon de 50 g de viande de porc hachée et une sonde de température externe (de type CTN, Testo AG 06101720-001 [thermistance à coefficient de température négatif], Testo®, Allemagne) a été placée dans la cellule de cuisson et l’enceinte climatique. Les sondes étaient reliées à un enregistreur (datalogger Testo 171, Testo®, Allemagne) dont la fréquence d’enregistrement de la température a été fixée à une acquisition par minute (Figure 1).

Figure 1 : Courbes Temps-Température de cuisson-refroidissement (barème standard versus barème lent) appliquées aux échantillons de jambon cuit modèle.
La température de 4°C est indiquée par la ligne rouge en pointillé.

Le barème de cuisson et de refroidissement « standard » (VP70,10 proche de 144 min, germe de référence Enterococcus faecalis) présentait les caractéristiques suivantes :
- cuisson : température à cœur de +69,3°C atteinte en 550 min ;
- refroidissement : diminution de la température à cœur de +69,3°C à +8°C en 425 min et de +8°C à +4°C en 175 min (durée de refroidissement équivalente à 10 h).
Le barème de cuisson et de refroidissement « lent » (VP70,10 proche de 175 min, germe de référence Enterococcus faecalis) présentait les caractéristiques suivantes :
- cuisson : température à cœur de +67,7°C atteinte en 870 min ;
- refroidissement : diminution de la température à cœur de +67,7°C à +8°C en 1290 min et de +8°C à +4°C en 420 min (durée de refroidissement équivalente à 28,5 h).

Afin de pallier une contrainte de mise en œuvre expérimentale, les échantillons ont dû être entreposés dans le four éteint environ 3,5 heures (barème incluant le refroidissement standard) ou 4,5 heures (barème incluant le refroidissement lent) avant le démarrage de la cuisson. Lors du démarrage de la cuisson, les températures à cœur des échantillons étaient relativement proches entre les deux barèmes de cuisson et refroidissement testés, avec des valeurs respectives de 12,1°C et 13,1°C

II.6. Conditions de conservation
Les échantillons de jambon cuit modèle ont été conservés durant 49 jours selon le scénario suivant :
14 jours à +4 °C, 7 jours à +8°C suivis d’une rupture de la chaine du froid pendant 1 h à +20 C, 28 jours à +8°C.
Ces conditions ont été reproduites dans des enceintes climatiques réfrigérées Sanyo MIR-254.

II.7. Analyses microbiologiques
Sept points d’analyse ont été effectués : J0 avant cuisson/refroidissement (J0av) ou après cuisson/refroidissement (J0ap), J20, J25, J29, J35 et J49. A chaque point d’analyse, trois échantillons inoculés par recette ont été analysés pour le dénombrement de C. botulinum présomptifs sur gélose Tryptone Sulfite après 24 à 48h d’incubation en anaérobiose à 30°C. A J0ap et J49, ces mêmes échantillons ont été utilisés pour dénombrer la flore lactique sur gélose MRS après 72 h d’incubation à 30°C en aérobiose.
Un dénombrement de la flore aérobie mésophile totale (FAMT) sur gélose PCA après 72 h d’incubation à 30°C a été effectué à J0av, J0ap et J49 à partir de trois échantillons non inoculés de la recette témoin RT. Pour la recette témoin RT, trois échantillons non inoculés ont été analysés à J0av, J0ap et J49 pour vérifier le niveau de contamination naturelle par des bactéries anaérobies sulfito-réductrices dont C. botulinum. Tous étaient inférieurs à la limite de quantification de la méthode utilisée (< 0,7 Log10 UFC/g), quelle que soit le stade d’analyse (données non montrées).

II.8. Calcul du potentiel de croissance de C. botulinum gr. II type B
Pour chaque recette et chaque barème de cuisson et de refroidissement mis en œuvre, la moyenne des trois échantillons analysés pour le dénombrement de C. botulinum à chaque point d’échantillonnage a été calculée. Les valeurs de potentiel de croissance (Δ) ont été calculées selon l’équation de la norme ISO 20976-1 : ∆ = logmax - logi où logmax est la valeur la plus élevée de ces moyennes et logi est la valeur de la moyenne à J0ap. Il a été considéré que les échantillons de jambon cuit modèle permettaient la croissance du pathogène lorsque Δ était supérieur à 0,5 Log10 UFC/g. Lorsque Δ était négatif, une valeur de 0 Log10 UFC/g a été indiquée.

II.9. Détection de la toxine botulique par bio-essai sur souris
La recherche de la toxine botulique a été réalisée à J0ap à partir de cinq échantillons de la recette témoin RT, ainsi qu’à partir de trois échantillons de chacune des recettes à J20, J25, J29, J35 et J49 par l’Institut Scientifique de la Santé Publique (Sciensano, Bruxelles, Belgique), selon la méthode de référence par bio-essai sur souris. Les tests ont été approuvés par le comité d’éthique de Sciensano (dossier n°20201104-01). A chaque date d’analyse, dans un souci d’éthique, dès qu’un échantillon d’une recette donnée était positif pour la toxine botulique, les 2 autres échantillons issus de la même recette n’ont pas été testés.
Brièvement, 25 g de chaque échantillon ont été homogénéisés dans 25 ml de tampon phosphate-gélatine (0,4 % de Na₂HPO₄, 0,2 % de gélatine, pH 6,2). Après centrifugation, le surnageant a été filtré avec un filtre de 0,45 μm. Le filtrat obtenu a été administré à deux souris par injection intrapéritonéale, à raison de 400 μl par souris. Les animaux ont été surveillés pendant une période de quatre jours afin de détecter l’apparition de symptômes du botulisme. En cas d’apparition de symptômes et/ou de mortalité, un test de séroneutralisation a été réalisé afin de confirmer la présence de la toxine botulique de type B (BoNT/B). Pour ce test, deux souris témoins ont reçu par voie intrapéritonéale le filtrat (400 μl par souris), tandis que deux autres souris ont reçu par voie intrapéritonéale un mélange composé du filtrat (400 μl) et d’anticorps neutralisants anti-BoNT/B (NIBSC ; 100 μl à 10 UI/ml). Un échantillon était considéré comme positif pour la BoNT/B lorsque les souris témoins présentaient des symptômes du botulisme, tandis que les souris ayant reçu les anticorps étaient exemptes de symptômes. La sensibilité du test est exprimée en « DL50 » (quantité de produit, administrée en une seule fois, qui cause la mort de 50 % d'un groupe d'animaux d'essai) ; celle-ci est de l’ordre de 5 à 10 pg par souris (Rossetto et Montecucco, 2019).

II.10. Analyses physico-chimiques
Des mesures du pH et de l’activité de l’eau (aw) ont été réalisées à J0ap et J49 à partir d’un échantillon non inoculé par recette. Un dosage du sodium a été réalisé à J0ap à partir de trois échantillons non inoculés par recette. Un dosage des nitrite et nitrate résiduels a été réalisé à J0ap et J49 à partir de trois échantillons non inoculés par recette. Le jus de cuisson des échantillons a été retiré et le produit a été essuyé avec du papier absorbant avant analyse.

II.10.1. Mesure du pH
Le pH a été mesuré selon la méthode destructive décrite dans la norme ISO 2917 : 1999 « Viandes et produits à base de viande – Mesurage du pH (méthode de référence) », au moyen d’un pH-mètre Knick 765 CALIMATIC® (Knick, Allemagne) avec correction de la valeur de pH en fonction de la température. Le pH-mètre était équipé d’une électrode combinée Mettler-Toledo® LoT406-M6-DXK-S7/25 (Urdorf, Suisse) pour mesure dans les aliments solides et d’une sonde de température Knick® PT1000. La valeur de pH a été lue directement sur l’affichage de l’appareil, à 0,01 unité près et arrondie à 0,05 unités, tenant compte de l’incertitude de mesure.

II.10.2. Mesure de l’aw
La méthode utilisée est une méthode interne du laboratoire basée sur les recommandations de la norme ISO 18787 : 2017. L’activité de l’eau (aw) des échantillons a été mesurée au moyen d’un aw-mètre Aqualab® 4TE (Meter Group, Allemagne), gradué à 0,001 unité d’aw et dont la température de la micro-enceinte est maîtrisée à ± 1 °C près. L’aw est déterminée sur la base de la mesure du point de rosée dans la micro-enceinte à +25 °C et arrondie à 0,01 unité aw.

II.10.3. Analyse de la teneur en sodium
La teneur en sodium a été mesurée par spectrométrie d’émission optique à plasma à couplage inductif (ICP-OES) au laboratoire LABEXIA (Quimper, France). L’analyse est réalisée à partir d’une prise d’essai de 2 g provenant d’un broyat homogène de l’échantillon (200 g minimum). La solution d’essai, obtenue par minéralisation par voie humide basse pression (système ouvert), a été nébulisée puis l’aérosol transféré dans un plasma d’argon induit par haute fréquence. Après atomisation et ionisation des éléments, la concentration en sodium a été déterminée par spectrométrie d'émission atomique sur la base de l’intensité de la lumière émise à des longueurs d’onde spécifiques. La teneur équivalente en NaCl (Na (%) × 2,5) a été exprimée en g NaCl / kg de produit.

II.10.4. Analyses des teneurs en nitrites et nitrates
La teneur en nitrites a été déterminée selon la norme ISO 2918 : 1975 « Viandes et produits à base de viande – Détermination de la teneur en nitrites (Méthode de référence) » adaptée en interne. Elle est exprimée en mg de nitrite de sodium / kg de produit. La teneur en nitrates a été mesurée après réduction des nitrates en nitrites selon la méthode de Jones (1983) qui constitue une alternative à l’utilisation d’une colonne au cadmium. Elle est exprimée en mg de nitrate de sodium / kg de produit.

II.11. Analyses statistiques
Une seule expérience a été menée, avec l’analyse d’un ou trois échantillons (selon l’analyse effectuée) par modalité testée. En raison du faible nombre de réplicats, aucune analyse statistique n’a été réalisée.

III. RESULTATS ET DISCUSSION

III.1. Caractéristiques physico-chimiques des échantillons de jambon cuit modèle
Les valeurs d’aw et de pH des échantillons de jambon cuit modèle étaient relativement homogènes entre les différentes recettes, et ce, quel que soit le barème de cuisson/refroidissement testé (Tableaux 2A et 2B). Ces valeurs correspondent à celles habituellement observées pour du jambon cuit (données internes). Ces paramètres sont restés stables durant la conservation, avec des valeurs moyennes (toutes dates, recettes et barèmes de cuisson et refroidissement confondus) de 0,99 ± 0,006 et 6,14 ± 0,04 unités, respectivement.
Les niveaux de sel mesurés à partir du dosage des ions sodium étaient relativement cohérents par rapport aux valeurs cibles attendues (Tableaux 2A et 2B). Les écarts mineurs observés (jusqu’à 0,9 g/kg) restent représentatifs de l’écart de pesée possible en entreprise, voire d’une éventuelle hétérogénéité de répartition de la saumure dans les muscles.
Compte tenu des réactions de transformation des nitrites et des nitrates dans les produits à base de viande, leur dosage et l’interprétation des résultats sont extrêmement complexes et ne peuvent être dissociés. Le règlement (CE) n°1333/2008 précise par ailleurs que des nitrates peuvent être présents dans certains produits à base de viande traités thermiquement, en raison de la conversion naturelle des nitrites en nitrates dans un milieu de faible acidité (Code des usages de la charcuterie, de la salaison et des conserves de viandes). Dans cet essai, alors qu’aucun nitrate n’a été ajouté, les teneurs en nitrates oscillaient à J0ap entre 5,3 et 9,3 mg NaNO3/kg pour les recettes supplémentées en sel nitrité (versus 1,4 à 4,8 mg NaNO3/kg pour celles sans sel nitrité ajouté), quel que soit le barème de cuisson et refroidissement appliqué (Tableaux 2A et 2B). L’apport de nitrates par l’eau déminéralisée utilisée est peu probable ou négligeable (à noter que l’eau du réseau peut toutefois en contenir) ; cependant un apport par la viande fraiche n’est pas exclu (ANSES, 2022 ; Bianco Junior et al., 2022). A titre indicatif, Bianco et al. (2022) ont mesuré des teneurs en nitrates dans des échantillons de viande fraiche de porc (n = 30) allant de 7,8 à 25,2 mg NaNO3/kg. Pour les recettes supplémentées en sel nitrité, les taux résiduels de nitrites étaient relativement faibles (≤ 5,7 mg NaNO2/kg), bien que conformes à ceux habituellement mesurés (i.e. < 20 mg/kg, Talon et al., 2015). Ceci s’explique par l’importante réactivité du nitrite, laquelle était par ailleurs favorisée par la présence d’érythorbate de sodium. Ce dernier permet la réduction du nitrite en favorisant le passage de l’acide nitreux (HNO2) en oxyde nitrique (NO), ainsi que la réduction du fer ferrique de l’hème en fer ferreux, promouvant ainsi le développement de la couleur via la formation de nitrosomyoglobine. A noter qu’aucun nitrite résiduel n'a été détecté dans les recettes sans sel nitrité ajouté (< 1 mg NaNO2/kg). Aucune différence majeure n’a pu être mise en évidence entre les teneurs en nitrites/nitrates des jambons cuits issus des deux barèmes de cuisson et de refroidissement testés.

Tableaux 2 : Caractéristiques physico-chimiques des jambons cuits modèles issus des différentes recettes testées et ayant subi le barème de cuisson et de refroidissement « standard » (A) ou « lent » (B).
Les valeurs moyennes ± SD affichées pour les teneurs en sel (NaCl), en nitrite de sodium (NaNO2) et en nitrate de sodium (NaNO3) ont été obtenues à partir de mesures réalisées sur trois échantillons différents.

AB
*NR = Non réalisée

III.2. Caractéristiques microbiologiques des échantillons de jambon cuit modèle
La cuisson a permis de réduire la population en flore aérobie mésophile totale (FAMT) des jambons, passant de 4,41 ± 0,09 Log10 UFC/g en moyenne avant cuisson à 2,22 ± 1,14 Log10 UFC/g après cuisson et refroidissement, indépendamment du barème mis en œuvre (Tableau 3). Cette flore résiduelle était certainement composée de bactéries sporulées (par exemple du genre Bacillus et genres apparentés) ou de cellules végétatives thermoduriques, lesquelles n’ont toutefois pas été retrouvées en fin de conservation (< 0,7 Log10 UFC/g). La flore lactique était inférieure à la limite de quantification de la méthode utilisée à J0ap (i.e. < 0,7 Log10 UFC/g). Une population résiduelle (jusqu’à 2,7 ± 0,44 Log10 UFC/g en moyenne) a cependant été quantifiée dans les échantillons des recettes R3 et R4 en fin de conservation.

Tableau 3 : Populations de flore lactique (Log10 UFC/g) dans les échantillons de jambon cuit modèle issus des différentes recettes à J0av, J0ap et J49, pour les 2 barèmes de cuisson et de refroidissement notés « standard » et « lent » (pour chaque modalité, valeur moyenne ± SD calculée à partir de trois échantillons différents).
Les populations en flore mésophile totale dénombrées, pour la recette témoin RT uniquement, sont notées entre parenthèses et en italique. Lorsque les populations étaient inférieures au seuil de quantification de la méthode, le résultat < 0,7 Log10 UFC/g est mentionné.
*NR = Non réalisée

III.3. Croissance et toxinogenèse de C. botulinum gr. II type B dans les échantillons de jambon cuit modèle
En fin de refroidissement (J0ap), aucune toxine botulique n’a été détectée dans la recette témoin, et ce, quel que soit le barème de cuisson et de refroidissement testé (Tableau 4). Ces résultats rejoignent ceux d’une précédente étude où des souches de C. botulinum gr. I (type A) et gr. II (type B) n’étaient pas capables de se développer et de produire leurs toxines botuliques durant une phase de refroidissement prolongée (27 h dont 23 h entre 48 °C et 4 °C, plage de température susceptible de permettre la croissance de C. botulinum), et ce, même pour la recette sans sel nitrité ajouté (Frémaux et al., 2020).
Dans les conditions de conservation testées, une détection positive de la toxine botulique a été observée dès le premier point d’analyse (J20, i.e. après seulement 6 jours à 8 C) pour les recettes sans sel nitrité ajouté (RT, R1 et R2) cuites et refroidies selon le barème lent. Un résultat similaire a été obtenu pour les recettes RT et R1 soumises au barème de cuisson et de refroidissement standard, alors que la recette R2, exempte de sel nitrité mais avec une dose en NaCl ajoutée de 18 g/kg (versus 13,5 g/kg pour R1), était positive à partir de J25 (i.e. après 11 jours à 8°C). En comparaison, l’utilisation d’une dose de 30 mg NaNO2/kg (avec 13,5 ou 18 g NaCl par kg de produit) permettait d’inhiber la croissance et la toxinogenèse dans les échantillons cuits et refroidis selon le barème standard, mais pas dans les échantillons cuits et refroidis suivant le barème lent. En revanche, aucune toxine botulique n’a été détectée dans la recette R5 préparée avec 60 mg NaNO2/kg, quel que soit le barème de cuisson et de refroidissement testé.

Tableau 4 : Détection de la toxine botulique de type B par bio-essai dans les échantillons de jambon cuit modèle issus des différentes recettes, cuits et refroidis selon le barème « standard » versus « lent » (nombre d’échantillon(s) positif(s)/nombre total d’échantillons testés).*NR = Non réalisée

Sur la base des données de dénombrement obtenues, un résultat contradictoire a été obtenu pour la recette R2 soumise au barème de cuisson et de refroidissement standard ; pourtant toxine-positive dès J25. Cette recette présentait un potentiel de croissance de 0 Log10 UFC/g (Figure 2). Même si les échantillons analysés pour le dénombrement du pathogène et ceux envoyés pour la détection de toxines botuliques sont systématiquement différents, l’effet échantillonnage est peu probable au vu du protocole employé et la multiplicité des analyses réalisées au cours de la conservation. Il est toutefois possible que cet écart soit lié au développement d’une mince fraction de cellules, laquelle ait pu produire une quantité détectable de toxines botuliques par bio-essai dont le niveau de sensibilité est supérieur à celui des analyses de dénombrements. A cela s’ajoute la difficulté de cultiver les souches de C. botulinum gr. II type B utilisées, à l’origine de résultats de dénombrement parfois hétérogènes entre les échantillons analysés. Ces éléments soulignent la nécessité de systématiquement effectuer la recherche de la toxine botulique lors de la réalisation d’un test de croissance impliquant C. botulinum, comme précédemment suggéré par Lebrun et al. (2020).
Lors d’une précédente étude il avait été démontré qu’une dose de 30 mg NaNO2/kg suffisait à prévenir la croissance de C. botulinum gr. II type B et la production de toxine associée dans le même jambon cuit modèle cuit et refroidi selon un barème standard et conservé selon un scénario temps/températures similaire à celui mis en œuvre dans la présente étude (Lebrun et al., 2020). Les données de la présente étude démontrent que cette dose est insuffisante dans le cas de jambons soumis à un cycle de cuisson et de refroidissement plus lent, incluant notamment une durée de refroidissement prolongée équivalente à 28,5h (dont ≈ 23,5 h entre 45 C et 4 C, plage de température susceptible de supporter le développement de C. botulinum gr. II type B) ; une situation pouvant être rencontrée par exemple lors d’incidents de fabrication, au niveau de points chauds dans certaines cellules de refroidissement ou lors du refroidissement de très grosses pièces de jambon cuit.
Dans ce cas, une teneur ajoutée de 60 mg NaNO2/kg est nécessaire pour inhiber la croissance et la toxinogenèse de C. botulinum gr. II type B dans le jambon cuit modèle conservé durant 14 jours à +4°C suivis de 35 jours à +8°C et avec une rupture de la chaine du froid d’1 h à +20°C à J21. Ces résultats montrent que la maîtrise du danger C. botulinum gr. II type B dans le jambon cuit est la résultante de multiples facteurs étroitement liés les uns aux autres. C’est le maintien de cet équilibre multifactoriel qui permet de garantir la sécurité du produit au regard de ce pathogène.

Figure 2 : Valeurs du potentiel de croissance (Δ) de C. botulinum gr. II type B (Log10 UFC/g) obtenues pour les différentes recettes testées en fonction du barème de cuisson et de refroidissement utilisé.
Les valeurs supérieures à 0,5 Log10 UFC/g présentent un fond rouge plus ou moins prononcé en fonction des valeurs (moyenne de 3 mesures) plus ou moins élevées calculées.

IV. CONCLUSION

Dans les conditions de conservation testées, l’utilisation d’une dose de 30 mg NaNO2/kg a permis d’inhiber la croissance de C. botulinum gr. II type B et la toxinogenèse associée dans les échantillons de jambon cuit modèle soumis à un barème de cuisson et de refroidissement standard (avec notamment un refroidissement d’une durée de 10 h), contrairement à ceux cuits et refroidis suivant le barème lent (incluant notamment un refroidissement d’une durée de 28,5 h dont environ 23,5 h entre 45°C et 4°C, plage de température susceptible de supporter le développement de C. botulinum gr. II type B), et ce, de manière indépendante de la dose ajoutée en NaCl (13,5 ou 18 g/kg). Seule une dose ajoutée de 60 mg NaNO2/kg (combinée à une dose en NaCl de 13,5 g/kg) a empêché la croissance et la production associée de toxine botulique dans le jambon cuit modèle, quel que soit le barème de cuisson et de refroidissement appliqué.
A noter que cette dose d’emploi en nitrites de sodium est inférieure à celles imposées par le code des usages de la charcuterie, de la salaison et des conserves de viandes en France (i.e. 90 mg NaNO2 / kg) et la réglementation européenne (i.e. 120 mg NaNO2 / kg) (Règlement (UE) 2023/2108). Ces résultats soulignent que la maîtrise du danger C. botulinum gr. II type B dans le jambon cuit est la résultante de multiples facteurs étroitement liés les uns aux autres. Seul le maintien de cet équilibre permet de garantir la sécurité du produit au regard de ce pathogène.
Par ailleurs, les doses ajoutées de nitrites de sodium trouvées efficaces dans la présente étude ne sont qu’indicatives, obtenues à partir d’un jambon cuit modèle dont la composition homogène favorise la reproductibilité des essais et la comparabilité des résultats. La dose d’emploi recommandée doit être ajustée afin de tenir compte de la variabilité des pratiques et des procédés rencontrés dans la filière. Il est également essentiel pour les professionnels d’optimiser leurs procédés de préparation de la saumure, d’injection et de barattage afin de favoriser une répartition homogène des nitrites dans leurs produits. Par ailleurs, si l’excellente cohérence des résultats obtenus souligne une certaine robustesse quant aux conclusions émises, il serait toutefois nécessaire de compléter cette étude avec des répétitions indépendantes supplémentaires.

Références